新型コロナウイルスと弊社製品

新型コロナウィルスに対して、何が出来るか

こちらでは、新型コロナウイルスに対するAntiCancer Inc.™弊社製品の有用性を説くために「SHORT NOTE」という論文を引用させて頂きます。
論文は広く公に発表されているものです。

とても分かりやすい説明になっております。わずか2分54秒の動画です。

2つの論文とメチオニナーゼの関係
 ウイルス感染細胞はメチオニン依存性になります。コロナウイルスは、メチル化のためにメチオニンを直接必要とします。 したがって、メチオニナーゼはメチオニン制限によりコロナウイルス感染を停止します。

コロナウイルス Short note

Coronavirus short note


Methionine Dependence of Virus-Infected Cells
ウイルス感染細胞のメチオニン依存性
   *コロナウイルスを含めたウイルス全般

ヒトサイトメガロウイルスを非生産的に感染させたマウス胚細胞は、メチオニンの代わりにホモシステインを含む培地で増殖する能力の低下により、非感染細胞とは異なりました。
両方の種類の培地で増殖したマウス胚細胞のウイルス感染により、タンパク質合成が増加しました。
ホモシステインで増殖した感染細胞では、この増加に続いて急速に減少しました。
ホモシステイン置換の影響は、少量のメチオニン(0.1 mM)を添加することにより廃止できました。
48時間ホモシステイン上で成長した感染細胞におけるメチオニンの取り込みは、非感染細胞のそれよりも有意に高まりました。
メチオニン依存性は、多くの形質転換および弱毒化された動物またはヒト細胞によって示されることが報告されている代謝異常です。
この欠陥は、in vitroで培養された細胞が、メチオニンがホモシステインに置換された培地で成長できないことを特徴としています。
内因性メチオニン生合成と異なる種類の細胞での利用に関する研究にかなりの注意が払われているが、ホモシステイン上で成長する細胞の能力を妨げる機能はまだ決定されていません。
ホモシステインの細胞成長と生存率の違いは、メチオニンの飢えに対するタンパク質合成の感度の違いと関連していることを以前に示しました。
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)による非ヒト細胞の非生産的感染は、感染性ウイルスの繁殖が制限されるか、ウイルス粒子が不活性化される条件下で初期ウイルスタンパク質の産生が新規タンパク質合成を示すモデルシステムを提供します。
さらに、HCMVによる細胞の感染は、許容細胞と非許容細胞の両方で宿主タンパク質合成の刺激を引き起こします。
後者の細胞系を利用して、ウイルスによるタンパク質合成の変化が細胞のホモシステイン成長能力に影響を与える可能性を調べました。
   *上記メチオニンとコロナウイルスを含めたウイルス全般がポイントです。

材料と方法

マウス胚細胞(ME)の培養は、同系交配のBalb/cマウスの19日齢の胎児から標準的な方法で得られました。
細胞は、10%ウシ胎児血清を含み、抗生物質(100 pg硫酸ストレプトマイシンおよび100 UペニシリンG/ml)を含む鷲のMEMで日常的に増殖しました。
実験のために、この培地およびメチオニンの代わりに200個の@f-ホモシステイン-チオラクトンを含む同じ培地に100μMの葉酸および1.5pMヒドロキシコバラミンを補充しました。
これらの培地(Met+、およびMet- Hey+)には、透析ウシ胎児血清を使用しました。
血清は、使用前に1リットルあたり8gのNaCl、0.4gのKCl、1gのグルコース、および0.35gのNaHCOを含む溶液を3回交換して透析しました。
ガレットとリーソンの方法[26]で細胞をチェックし、マイコプラズマの混入がないことを確認しました。
これらの研究で使用されたHCMVの株は、スウェーデンのストックホルムにある国立細菌研究所から入手したAd-169でした。
ウイルスストックをヒト胚線維芽細胞で調製し、-130℃で保存しました。
ウイルス滴定は、ウェントワースとフレンチによって説明された方法に基づいたプラークアッセイによって行われました。
成長実験のために、細胞を約5〜7×lo4細胞/ mlの初期細胞密度で2mlのMet +培地とともに30.mmペトリ皿に接種しました。
24時間培養物にHCMVを5または10 PFU/細胞の感染多重度(MOI)で2時間感染させ、ハンクスの平衡塩溶液で3回洗浄し、Met +またはMet-Hey +培地で維持しました。
対照培養物には、ウイルス懸濁液とは反対の等量のウイルス希釈液、または不活化前に10 PFU/細胞のMO1で熱不活化ウイルス(56°C、30分間)を接種しました。
あらゆる種類の培養物の成長率は、細胞数の決定により24時間ごとに評価されました。
各データポイントは、3つの独立した実験の結果です。
すべての場合において、3つのレプリカ文化の成長は本質的に区別できませんでした。
タンパク質合成の研究は並行培養で行われました。
一定の間隔で、培養物を30分間1&iのL- [3H]バリン(sp act 2 Ci / mmol; Amersham International Ltd)で標識し、前述のように処理しました。
非感染ME細胞で取り込み実験を行い、5または10 PFU /細胞のMO1で同じ細胞にHCMVを感染させ、両方の種類の培地で24時間および48時間増殖させました。
Foster and Pardeeに記載された方法により、37℃で3、5、10分間インキュベートした後、取り込みを測定しました。
インキュベーション培地は、1mlのグルコースを含むPBS 2mlから構成されました。
すべてのサンプルの放射能は、Beckman LS 3150 P液体シンチレーション分光計で測定しました。
結果は、10 ^ 3細胞あたりのcpmとして表されます。
接種された培養中の細胞に存在する感染性ウイルスを定量するために、HBSSで2回洗浄した後の2枚のペトリ皿からME細胞を1 mlのMEMにこすり落として回収し、Ten-Broeck組織粉砕機で破壊しました。
250gでの遠心分離により細胞片を除去し、プラークアッセイにより上清についてウイルスを検査しました。
光学顕微鏡による形態学的研究では、カバースリップ上の細胞培養物をブアンで固定し、ヘマトキシリンとエオシン(H + E)で染色しました。

結果

図1は、両方の種類の培地で培養された非感染およびHCMV感染二次ME細胞で行われた増殖実験の結果を示しています。
感染していないME細胞は、Met +培地と同等にホモシステインで増殖しました。
増殖曲線の比較からわかるように、ウイルス感染(MOI 10 PFU /細胞)は、Met +培地での細胞の増殖に大きな影響を与えませんでしたが、メチオニンの代わりにホモシステインを含む培地で細胞増殖の障害を引き起こしました。
同じ図に示されるように、感染細胞のホモシステイン単独での増殖能力の低下は、0.1 mMメチオニンの存在下で完全に回復しました。
ホモシステインによるメチオニンの置換とウイルス感染の両方の種類の培地で成長した細胞のタンパク質合成に対する効果を評価するために設計された実験の結果を図2に示します。
ホモシステインの代わりにメチオニンが使用された後、感染していない細胞のタンパク質合成は損なわれていません。
ME細胞Met +培地のHCMVによる感染は、タンパク質合成の用量依存的増加をもたらしました。
この培地で増殖した感染細胞へのバリンの取り込みは、感染後24時間で2〜3倍増加し、感染後も残っていました。
ホモシステイン上で増殖した感染細胞のタンパク質合成応答は、感染後24の後、急激な減少に続く有意な(P <0.01)増加を示しました。
細胞がホモシステインの存在およびバリン取り込みのパターンが0.1μmの場合、細胞はMet +培地で増殖しました。
ME細胞への熱再活性化ウイルスの感染は、使用する培地の種類に関係なく、タンパク質合成の細胞増殖速度に影響を与えません(データは示していません)。
ME細胞によるメチオニンの取り込みを決定するために、同様の実験条件が採用されました。
24時間増殖させた感染細胞によるメチオニンの取り込みの時間経過は、使用するナトリウムに関係なく、非感染細胞のそれと類似していました。
しかし、細胞をホモシステインで48時間培養すると、メチオニン感染細胞の取り込みは、非感染細胞による対応する取り込みよりも有意に高いものでした。
5日間にわたって、両方の種類の培地で毎日培養した培養上清または全細胞抽出物のウイルス感染性を測定しました。
細胞が10 PFU /細胞の多重度で感染した場合でも、感染後いつでもかなりの量の感染性子孫ウイルスを検出できませんでした。
感染後6〜24時間の感染培養物の染色により、好塩基球増加を伴う丸い細胞の発生が明らかになりました。
MO1 5または10 PFU /細胞でそれぞれ感染後6〜12時間以内に、細胞の約25または50%が丸められました。
丸い細胞の割合は、使用した培地の種類とは無関係でした。

ディスカッション

ヒトサイトメガロウイルスによるヒトおよび非ヒト細胞の感染は、タンパク質合成の生成に関連する早期の細胞の丸めを引き起こします[19-251。
この研究で採用された実験条件下で、72時間にわたるホモシステインによるメチオニンの置換は、未感染または感染細胞の成長速度に影響を与えず、細胞の丸めやタンパク質合成の刺激などのウイルス感染の初期効果を妨げませんでした。
Met +培地で増殖した感染細胞とは対照的に、タンパク質合成の増加に続いて、ホモシステイン上で増殖した細胞が対照以下のレベルまで急速に減少しました。
感染した細胞のホモシステインでの成長能力の低下、およびタンパク質合成の低下は、そうでなければ成長を制限する量のメチオニンによって回復する可能性があります。
したがって、ホモシステインで増殖した感染細胞では、細胞内メチオニンの量が最適な細胞増殖またはタンパク質合成の変化に十分ではないと結論付けることができます。
この仮定は、ホモシステイン上で増殖した感染細胞では、このアミノ酸の含有量が時間とともに減少する可能性を示す取り込み実験の結果に裏付けがあります。
上記の感染した非形質転換細胞のメチオニン依存性に関連するいくつかの特徴は、新生細胞および形質転換細胞のメチオニン依存性の特徴と非常によく似ています。
最近、腫瘍および形質転換細胞のメチオニン依存性は、メチオニン代謝およびおそらくメチル化プロセス自体に関与する重要な遺伝子の過剰メチル化によることが提案されています。
メチオニンはタンパク質合成に利用され、Sアデノシルメチオニンに対しても活性化され、細胞内の主要なメチル基ドナーとして機能します。
HCMV感染細胞でメチオニン依存性がメチオニン飢餓だけでなく、メチル化プロセスの変化によっても発現されるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。


2つの論文とメチオニナーゼの関係
 ウイルス感染細胞はメチオニン依存性になります。コロナウイルスは、メチル化のためにメチオニンを直接必要とします。 したがって、メチオニナーゼはメチオニン制限によりコロナウイルス感染を停止します。

コロナウイルス メチルトランスフェラーゼ

コロナウイルス メチオニン


コロナウイルス非構造タンパク質16はCap-0結合
酵素保有(ヌクレオシド-2 O)-メチルトランスフェラーゼ活性

ポジティブ鎖RNAウイルスのコロナウイルス系列には、2003年の世界的な大流行の原因となった重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを含む、家畜、ペット、および人間の重要な病原体が含まれます。
異常に複雑なコロナウイルスのレプリカーゼ/トランスクリプターゼは、2つの大きなポリタンパク質から自己タンパク質分解的に誘導される15または16のウイルス特異的サブユニットで構成されています。
バイオインフォマティクスの予測に沿って、ネココロナウイルス非構造タンパク質16がS-アデノシル-L-メチオニン(AdoMet)に依存し、キャップ1形成が可能なRNA-メチルトランスフェラーゼ活性を持っていることを示しました。
精製された組換えFCoV nsp16は、短いキャップのRNAに選択的に結合します。
驚くべきことに、N7-メチルグアノシンキャップは結合の前提条件です。
高速液体クロマトグラフィー分析により、nsp16がAdoMetから最初の転写されたヌクレオチドの2 O位置へのメチル転移を媒介し、7MeGpppAC3-inが7MeGpppA2 OMeC3-6に変換されることが示されました。
11個のnsp16変異体の特性評価により、酵素の推定四分子K-D-K-E触媒としての残基K45、D129、K169、およびE202の以前の同定がサポートされました。
さらに、ワクシニアウイルスMTase VP39による基質認識に関与する芳香族残基の機能的対応物である可能性のあるFCoV nsp16の残基Y29およびF173は、基質結合と2 O-MTase活性の両方に不可欠であることがわかりました。
最後に、異なるAdoMet類似体の弱い阻害プロファイルは、nsp16が非定型AdoMet結合部位を進化させたことを示しています。
我々の結果は、コロナウイルスmRNAがcap-1を運び、2.0メチル化がグアニンN7メチル化に先行しなければならないイベントの順序に従い、2つのメチル化が続くことを示唆しており、後者のステップは未知のN7特異的MTアーゼによって実行されます。
コロナウイルス属とトロウイルス属を含むコロナウイルス科は、ニドウイルス目、アルテリウイルス科とロニウイルス科も含むポジティブ鎖/正鎖RNAウイルスの系統に属します(レビューについては、参考文献28を参照)。
コロナウイルス(CoV)は、人間、家畜、身近な動物の呼吸器疾患および腸疾患に頻繁に関連付けられています。
近年、新たに出現した重症急性呼吸器症候群CoV(SARS-CoV)による2003年の流行と、2つの追加のヒト病原体を含む他のいくつかの新しい家族の識別に続いて、彼らは世界的な注目を集めました。
抗原および遺伝子分析に基づいて、CoVは3つのグループに分けられ、グループ3はトリCoVを表し、グループ2はマウス肝炎ウイルス(MHV)、ヒトCoV(HCoV)OC43およびHKU1、SARS-CoVなどのウイルスを含みます。
CoVグループ1には、とりわけ、HCoV 229EおよびNL63、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、イヌおよびネコのCoV(FCoV)が含まれます。
FCoVの感染は猫と子猫で非常に一般的です。
FCoV感染は通常一過性であり、軽度の胃腸疾患をもたらしますが、ウイルスはかなりの割合の症例で持続する可能性があります。
FCoVに感染した猫のごく一部は、ネコ伝染性腹膜炎(FIP)として知られる致命的な免疫介在性疾患を発症します。
病原性の根拠は議論の余地があり、1つの示唆は、持続的に感染する腸内FCoVがその病原性を高める変異を獲得したときにFIPウイルス(FIPV)が生じることです。
他のニドウイルスについて、CoVの大きなゲノム(27から32 kb)はポリシストロン性であり、ウイルスの非構造タンパク質(nsps)の複製をコードする2つの大きなオープンリーディングフレーム(ORF1aおよびORF1b)が約3分の2を占めています。
複製酵素ORFの下流の遺伝子は、構造的およびウイルス特異的なアクセサリータンパク質をコードします。
ゲノム発現はORF1aおよびORF1bの翻訳から始まり、おそらくキャップ依存性メカニズムによるものであり(44、80)、ORF1の発現に1リボソームフレームシフトが関与しています(9)。 結果として生じる2つのレプリカーゼポリタンパク質、pp1aおよびpp1abは、2つまたは3つのウイルスプロテアーゼによって処理され、nsp1からnsp16と呼ばれる16の最終産物を生成します(28、76、87)。 これらの切断産物は、複製複製複合体と呼ばれる大きな膜固定型マルチ酵素複合体に集合し、ゲノム複製およびサブゲノムmRNA合成に必要なすべての機能を媒介します(38、78、79)。 複製転写複合体には、RNA依存のRNAポリメラーゼ(nsp12 [13])、プロテアーゼ(nsp3およびnsp5 [4、49])、ヘリカーゼ/RNAトリホスファターゼ(nsp13 [40、73])が含まれています。 さらに、CoVゲノムは、特定のニドウイルスサブグループに固有のRNAプロセッシングアクティビティのセットか、他のいくつかのグループでのみ見つかるRNAウイルスをエンコードします(76)。 これらの機能には、ADPリボースホスファターゼ(nsp3のXまたはマクロドメイン[62])、最近発見された推定RNAプライマーゼ(nsp8 [37])、アネキソリボヌクレアーゼ(nsp14 [54])、およびニドウイルスウリジル酸特異的エンドリボヌクレアーゼ(NendoU nsp15 [39])が含まれます。 このグループの酵素には、S-アデノシル-ルメチオニン(AdoMet)依存性RNA(ヌクレオシド-2 O)メチルトランスフェラーゼ(2-MTase)(53、76、82)であると予測された機能的に特徴付けられていないnsp16も含まれます。

RNA 2 O-MTasesの特徴である、高度に保存された触媒テトラッド(K-D-K-E)が含まれています(12、19、22、23)。SARS-CoV nsp16のMTaseコアの3次元モデルは、テンプレートとしてレオウイルスタンパク質2の2-MTaseドメインを使用して、構造予測サーバー(3D メタ予測)によって生成されました(82)。


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